Mae gwenwyn neidr yn cynnwys ensymau sy'n hydrolyze bondiau ester carbocsyl.Y swbstradau ar gyfer hydrolysis yw ffosffolipidau, acetylcholine ac asetad aromatig.Mae'r ensymau hyn yn cynnwys tri math: ffosffolipase, acetylcholinesterase ac esterase aromatig.Gall arginine esterase mewn gwenwyn neidr hefyd hydrolyze arginine synthetig neu lysin, ond mae'n bennaf hydrolyzes bondiau peptid protein mewn natur, felly mae'n perthyn i proteas.Mae'r ensymau a drafodir yma yn gweithredu ar swbstradau ester yn unig ac ni allant weithredu ar unrhyw fond peptid.Ymhlith yr ensymau hyn, mae swyddogaethau biolegol acetylcholinesterase a phospholipase yn bwysicach ac wedi'u hastudio'n llawn.Mae gan rai gwenwynau neidr weithgaredd esteras aromatig cryf, a all hydrolyze p-nitrophenyl ethyl ester, a - neu P-naphthalene asetad ac indole ethyl ester.Nid yw'n hysbys o hyd a yw'r gweithgaredd hwn yn cael ei gynhyrchu gan ensym annibynnol neu sgîl-effaith hysbys o carboxylesterase, heb sôn am ei arwyddocâd biolegol.Pan adweithiodd gwenwyn Agkistrodon halys Japonicus ag ester p-nitrophenyl ethyl ac indole ethyl ester, ni ddarganfuwyd hydrolysadau p-nitrophenol ac indole ffenol;I'r gwrthwyneb, os yw'r esters hyn yn adweithio â gwenwyn neidr isrywogaeth cobra Zhoushan a gwenwyn neidr Bungarus multicinctus, byddant yn cael eu hydrolysu'n gyflym.Mae'n hysbys bod gan y gwenwynau cobra hyn weithgaredd colinesterase cryf, a all fod yn gyfrifol am hydrolysis y swbstradau uchod.Mewn gwirionedd, mae Mclean et al.(1971) fod llawer o wenwynau nadroedd sy'n perthyn i'r teulu Cobra yn gallu hydroleiddio ester ethyl indole, ester ethyl naphthalene ac ester naphthalene butyl.Daw’r gwenwynau neidr hyn o: cobra, cobra gwddf du, cobra â gwefus du, cobra euraidd, cobra Eifftaidd, cobra’r brenin, cobra mamba euraidd, mamba du a mamba â gwefusau gwyn (mae D. aw yn dal i adnabod neidr gribell rhombola ddwyreiniol
Gall y gwenwyn neidr hydrolyze methyl indole ethyl ester, sef y swbstrad ar gyfer pennu gweithgaredd cholinesterase mewn serwm, ond nid yw'r gwenwyn neidr hwn yn dangos gweithgaredd colinesterase.Mae hyn yn dangos bod esteras anhysbys mewn gwenwyn cobra, sy'n wahanol i cholinesterase.Er mwyn deall natur yr ensym hwn, mae angen rhagor o waith gwahanu.
1 、 Ffosffolipase A2
(I) Trosolwg
Mae ffosffolipas yn ensym sy'n gallu hydroleiddio glyseryl ffosffad.Mae yna 5 math o ffosffolipase mewn natur, sef ffosffolipase A2 a phospholipase
A. , phospholipase B, phospholipase C a phospholipase D. Mae gwenwyn neidr yn bennaf yn cynnwys ffosffolipase A2 (PLA2), mae ychydig o wenwynau neidr yn cynnwys ffosffolipase B, ac mae ffosffolipasau eraill i'w cael yn bennaf mewn meinweoedd anifeiliaid a bacteria.Mae Ffig. 3-11-4 yn dangos safle gweithredu'r ffosffolipasau hyn ar hydrolysis swbstrad.
Ymhlith ffosffolipasau, mae PLA2 wedi'i astudio'n fwy.Efallai mai dyma'r ensym a astudiwyd fwyaf mewn gwenwyn neidr.Ei swbstrad yw'r bond ester ar ail safle Sn-3-glycerophosphate.Mae'r ensym hwn i'w gael yn eang mewn gwenwyn neidr, gwenwyn gwenyn, gwenwyn sgorpion a meinweoedd anifeiliaid, ac mae PLA2 yn doreithiog mewn pedwar gwenwyn neidr teuluol.Oherwydd bod yr ensym hwn yn torri celloedd coch y gwaed ac yn achosi hemolysis, fe'i gelwir hefyd yn “hemolysin”.Mae rhai pobl hefyd yn galw PLA2 lecithinase hemolytic.
Canfu Ludeeke gyntaf y gall gwenwyn neidr gynhyrchu cyfansoddyn hemolytig trwy weithredu ar lecithin trwy ensymau.Yn ddiweddarach, mae Delezenne et al.profi, pan fydd gwenwyn cobra yn gweithredu ar serwm ceffyl neu felynwy, mae'n ffurfio sylwedd hemolytig.Mae'n hysbys bellach y gall PLA2 weithredu'n uniongyrchol ar ffosffolipidau'r bilen erythrocyte, gan ddinistrio strwythur y bilen erythrocyte ac achosi hemolysis uniongyrchol;Gall hefyd weithredu ar serwm neu lecithin ychwanegol i gynhyrchu lecithin hemolytig, sy'n gweithredu ar gelloedd coch y gwaed i gynhyrchu hemolysis anuniongyrchol.Er bod PLA2 yn helaeth yn y pedwar teulu o wenwynau nadroedd, mae cynnwys ensymau mewn gwahanol wenwynau nadroedd ychydig yn wahanol.Naidr gribell (C
Dim ond gweithgaredd PLA2 gwan a ddangosodd gwenwyn neidr.Mae Tabl 3-11-11 yn dangos cymhariaeth gweithgaredd PLA2 o 10 prif wenwyn nadroedd gwenwynig yn Tsieina.
Tabl 3-11-11 Cymhariaeth o weithgareddau ffosffolipase VIII o 10 gwenwyn neidr yn Tsieina
Gwenwyn neidr
Rhyddhau braster
Asid aliffatig,
Cjumol/mg)
Gweithgaredd hemolytig CHU50 / ^ g * ml)
Gwenwyn neidr
Rhyddhau asidau brasterog
(^raol/mg)
Gweithgaredd hemolytig “(HU50/ftg * 1111)
Najanaja atra
9. 62
unarddeg
Micracephal ofphis
pum pwynt un sero
kalyspallas
8. 68
dwy fil ac wyth cant
gracilis
V, craffter
7. 56
* * #
Ophiophagus Hannah
tri phwynt wyth dau
cant a deugain
Bnugarus fascatatus
7,56
dau cant wyth deg
B. amlgynctus
un pwynt naw chwech
dau cant wyth deg
Viper a russelli
saith pwynt sero tri
T, mucrosquamatus
un pwynt wyth pump
Siamensis
T. stejnegeri
0. 97
（2） Gwahanu a phuro
Mae cynnwys PLA2 mewn gwenwyn neidr yn fawr, ac mae'n sefydlog i wresogi, asid, alcali a denaturant, fel ei bod hi'n hawdd puro a gwahanu PLA2.Y dull cyffredin yw hidlo gel yn gyntaf ar y gwenwyn crai, yna cynnal cromatograffaeth cyfnewid ïon, a gellir ailadrodd y cam nesaf.Dylid nodi na ddylai rhewi-sychu PLA2 ar ôl cromatograffaeth cyfnewid ïon achosi agregu, oherwydd bod y broses rewi-sychu yn aml yn cynyddu cryfder ïonig y system, sy'n ffactor pwysig sy'n achosi agregu PLA2.Yn ogystal â'r dulliau cyffredinol uchod, mabwysiadwyd y dulliau canlynol hefyd: ① Wells et al.② Defnyddiwyd analog swbstrad PLA2 fel ligand ar gyfer cromatograffaeth affinedd.Gall y ligand hwn glymu i PLA2 mewn gwenwyn neidr gyda Ca2+.Defnyddir EDTA yn bennaf fel eluent.Ar ôl i Ca2+ gael ei dynnu, mae'r affinedd rhwng PLA2 a ligand yn lleihau, a gellir ei ddatgysylltu o ligand.Mae eraill yn defnyddio hydoddiant organig 30% neu 6mol/L wrea fel eluent.③ Perfformiwyd cromatograffaeth hydroffobig gyda PheiiylSephar0SeCL-4B i gael gwared ar olrhain PLA2 mewn cardiotocsin.④ Defnyddiwyd gwrthgorff gwrth PLA2 fel ligand i berfformio cromatograffaeth affinedd ar PLA2.
Hyd yn hyn, mae nifer fawr o wenwyn neidr PLAZ wedi'u puro.Tu et al.(1977) rhestru PLA2 wedi'i buro o wenwyn neidr cyn 1975. Yn y blynyddoedd diwethaf, mae nifer fawr o erthyglau am wahanu a phuro PLA2 wedi'u hadrodd bob blwyddyn.Yma, rydym yn canolbwyntio ar wahanu a phuro PLA gan ysgolheigion Tsieineaidd.
Roedd Chen Yuancong et al.(1981) yn gwahanu tair rhywogaeth PLA2 o wenwyn Agkistrodon halys Pallas yn Zhejiang, y gellir eu rhannu'n PLA2 asidig, niwtral ac alcalïaidd yn ôl eu pwyntiau isoelectric.Yn ôl ei wenwyndra, mae PLA2 niwtral yn fwy gwenwynig, sydd wedi'i nodi fel niwrotocsin presynaptig Agkistrodotoxin.Mae PLA2 alcalïaidd yn llai gwenwynig, ac nid oes gan PLA2 asidig bron unrhyw wenwyndra.Roedd Wu Xiangfu et al.(1984) yn cymharu nodweddion tri PLA2s, gan gynnwys pwysau moleciwlaidd, cyfansoddiad asid amino, N-terminal, pwynt isoelectric, sefydlogrwydd thermol, gweithgaredd ensymau, gwenwyndra a gweithgaredd hemolytig.Dangosodd y canlyniadau fod ganddynt bwysau moleciwlaidd tebyg a sefydlogrwydd thermol, ond roedd ganddynt wahaniaethau sylweddol mewn agweddau eraill.Yn yr agwedd ar weithgaredd ensymau, roedd gweithgaredd ensymau asid yn uwch na gweithgaredd ensymau alcalïaidd;Effaith hemolytig ensym alcalïaidd ar gelloedd gwaed coch llygod mawr oedd y cryfaf, ac yna ensym niwtral, ac ensym asid prin yn hemolyzed.Felly, dyfalir bod effaith hemolytig PLAZ yn gysylltiedig â gwefr moleciwl PLA2.Dywedodd Zhang Jingkang et al.(1981) wedi gwneud crisialau Agkistrodotoxin.Mae Tu Guangliang et al.(1983) fod PLA gwenwynig gyda phwynt isoelectric o 7. 6 wedi'i ynysu a'i buro o wenwyn Vipera rotundus o Fujian, a'i briodweddau ffisegol a chemegol, cyfansoddiad asid amino a'r dilyniant o 22 o weddillion asid amino yn y N -penderfynwyd terfynell.Roedd Li Yuesheng et al.(1985) ynysu a phuro PLA2 arall o wenwyn Viper rotundus yn Fujian.Is-uned y PLA2 * yw 13 800, y pwynt isoelectric yw 10.4, a'r gweithgaredd penodol yw 35/xnioI/miri mg。 Gyda lecithin fel y swbstrad, pH optimaidd yr ensym yw 8.0 a'r tymheredd gorau posibl yw 65 ° C. LD5 wedi'i chwistrellu'n fewnwythiennol mewn llygod.Mae'n 0.5 ± 0.12mg/kg.Mae gan yr ensym hwn effeithiau gwrthgeulo a hemolytig amlwg.Mae'r moleciwl PLA2 gwenwynig yn cynnwys 123 o weddillion o 18 math o asidau amino.Mae'r moleciwl yn gyfoethog mewn cystein (14), asid aspartig (14) a glycin (12), ond dim ond un methionin sy'n cynnwys, a'i derfynell N yw gweddillion serine.O'i gymharu â PLA2 ynysig gan Tuguang, mae'r pwysau moleciwlaidd a nifer y gweddillion asid amino o'r ddau isoenzymes yn debyg iawn, ac mae'r cyfansoddiad asid amino hefyd yn debyg iawn, ond mae nifer yr asid aspartig a gweddillion proline ychydig yn wahanol.Mae gwenwyn neidr cobra brenin Guangxi yn cynnwys PLA2 cyfoethog.Mae Shu Yuyan et al.(1989) ynysu PLA2 o'r gwenwyn, sydd â gweithgaredd penodol 3.6 gwaith yn uwch na'r gwenwyn gwreiddiol, pwysau moleciwlaidd o 13000, cyfansoddiad o 122 o weddillion asid amino, pwynt isoelectric o 8.9, a sefydlogrwydd thermol da.O arsylwi microsgop electron o effaith PLA2 sylfaenol ar gelloedd coch y gwaed, gellir gweld ei fod yn cael effaith amlwg ar bilen celloedd gwaed coch dynol, ond nid oes ganddo unrhyw effaith amlwg ar gelloedd gwaed coch geifr.Mae gan y PLA2 hwn effaith arafiad amlwg ar gyflymder electrofforetig celloedd gwaed coch mewn bodau dynol, geifr, cwningod a moch cwta.Roedd Chen et al.Gall yr ensym hwn atal agregu platennau a achosir gan ADP, colagen ac asid arachidonic sodiwm.Pan fo crynodiad PLA2 yn 10/xg/ml ~ lOOjug/ml, mae agregu platennau yn cael ei atal yn llwyr.Pe bai platennau wedi'u golchi yn cael eu defnyddio fel deunyddiau, ni allai PLA2 atal agregu ar y crynodiad o 20Mg/ml.Mae aspirin yn atalydd cyclooxygenase, a all atal effaith PLA2 ar blatennau.Gall PLA2 atal agregu platennau trwy hydrolysu asid arachidonic i syntheseiddio thromboxane A2.Astudiwyd cydffurfiad datrysiad PLA2 a gynhyrchwyd gan Agkistrodon halys Pallas venom yn Nhalaith Zhejiang trwy gyfrwng dichroism cylchol, fflworoleuedd ac amsugno UV.Dangosodd y canlyniadau arbrofol fod cydffurfiad prif gadwyn yr ensym hwn yn debyg i'r un math o ensym o rywogaethau a genera eraill, roedd gan y cydffurfiad sgerbwd ymwrthedd gwres da, ac roedd y newid strwythurol mewn amgylchedd asid yn gildroadwy.Nid yw'r cyfuniad o ysgogydd Ca2+ ac ensym yn effeithio ar amgylchedd gweddillion tryptoffan, tra bod yr atalydd Zn2+ yn gwneud y gwrthwyneb.Mae'r ffordd y mae gwerth pH hydoddiant yn effeithio ar actifedd ensymau yn wahanol i'r adweithyddion uchod.
Yn y broses o puro PLA2 o wenwyn neidr, ffenomen amlwg yw bod gwenwyn neidr yn cynnwys dau neu fwy o gopaon elution PLA2.Gellir esbonio'r ffenomen hon fel a ganlyn: ① oherwydd bodolaeth isosymau;② Mae un math o PLA2 wedi'i bolymeru i amrywiaeth o gymysgeddau PLA2 gyda phwysau moleciwlaidd amrywiol, y rhan fwyaf ohonynt yn yr ystod o 9 000 ~ 40 000;③ Mae'r cyfuniad o PLA2 a chydrannau gwenwyn neidr eraill yn cymhlethu PLA2;④ Oherwydd bod y bond amid yn PLA2 wedi'i hydrolysu, mae'r tâl yn newid.① a ② yn gyffredin, gyda dim ond ychydig o eithriadau, megis PLA2 yn CrWa/w gwenwyn neidr
Mae dwy sefyllfa: ① a ②.Mae'r trydydd cyflwr wedi'i ganfod yn PLA2 yng ngwenwyn y nadroedd canlynol: Oxyranus scutellatus, Parademansia microlepidota, Bothrops a^>er, gwiberod Palestina, gwiberod y tywod, a km neidr gribell ofnadwy.
Mae canlyniad achos ④ yn gwneud cyflymder mudo PLA2 yn newid yn ystod electrofforesis, ond nid yw'r cyfansoddiad asid amino yn newid.Gall peptidau gael eu torri gan hydrolysis, ond yn gyffredinol maent yn dal i gael eu rhwymo at ei gilydd gan fondiau disulfide.Mae gwenwyn neidr gribell y pwll dwyreiniol yn cynnwys dwy ffurf o PLA2, sef math a a math p PLA2 yn y drefn honno.Dim ond un asid amino yw'r gwahaniaeth rhwng y ddau fath hyn o PLA2, hynny yw, mae glutamine mewn un moleciwl PLA2 yn cael ei ddisodli gan asid glutamig yn y moleciwl PLA2 arall.Er nad yw'r union reswm dros y gwahaniaeth hwn yn glir, credir yn gyffredinol ei fod yn gysylltiedig â dadaminio PLA2.Os cedwir PLA2 yng ngwenwyn gwiberod Palestina yn gynnes gyda'r gwenwyn crai, bydd y grwpiau diwedd yn ei foleciwlau ensymau yn dod yn fwy nag o'r blaen.O C PLA2 wedi'i ynysu o wenwyn neidr mae dau N-terfynell wahanol, ac mae ei bwysau moleciwlaidd yn 30000. Gall y ffenomen hon gael ei achosi gan y dimer anghymesur o PLA2, sy'n debyg i'r dimer cymesur a ffurfiwyd gan PLA2 yn y gwenwyn neidr gribell dwyreiniol diamondback a neidr gribell ddur diemwnt gorllewinol.Mae'r cobra Asiaidd yn cynnwys llawer o isrywogaethau, ac nid yw rhai ohonynt yn bendant iawn o ran dosbarthiad.Er enghraifft, mae'r hyn a arferai gael ei alw'n isrywogaeth Caspian Allanol Cobra yn cael ei gydnabod bellach
Dylid ei briodoli i'r Môr Caspia Allanol Cobra.Gan fod yna lawer o isrywogaethau a'u bod yn gymysg â'i gilydd, mae cyfansoddiad gwenwyn neidr yn amrywio'n fawr oherwydd gwahanol ffynonellau, ac mae cynnwys isosymau PLA2 hefyd yn uchel.Er enghraifft, gwenwyn cobra
Darganfuwyd o leiaf 9 math o isosymau PLA2 o rywogaethau r^ll, a darganfuwyd 7 math o isosymau PLA2 yng ngwenwyn isrywogaeth cobra Caspian.Mae Durkin et al.(1981) astudio cynnwys PLA2 a nifer yr isosymau mewn gwahanol wenwynau nadroedd, gan gynnwys 18 gwenwyn cobra, 3 gwenwyn mamba, 5 gwenwyn gwiberod, 16 gwenwyn neidr gribell a 3 gwenwyn neidr y môr.Yn gyffredinol, mae gweithgaredd PLA2 gwenwyn cobra yn uchel, gyda llawer o isosymau.Mae gweithgaredd PLA2 ac isosymau gwenwyn gwiberod yn ganolig.Mae gweithgaredd PLA2 gwenwyn mamba a gwenwyn neidr gribell yn isel iawn neu ddim gweithgaredd PLA2.Mae gweithgaredd PLA2 gwenwyn neidr y môr hefyd yn isel.
Yn ystod y blynyddoedd diwethaf, ni adroddwyd bod PLA2 mewn gwenwyn neidr yn bodoli ar ffurf dimer gweithredol, fel neidr y rhombophora dwyreiniol (C. mae gwenwyn neidr yn cynnwys math a a math P PLA2, y ddau ohonynt yn cynnwys dwy is-uned union yr un fath. , a dimerase wedi
Gweithgaredd.Roedd Shen et al.hefyd yn cynnig mai dimer dimer PLA2 o wenwyn y neidr yw ffurf actif yr ensym.Mae'r astudiaeth o strwythur gofodol hefyd yn profi bod PLA2 o neidr gribell cefn diemwnt gorllewinol yn bodoli ar ffurf dimer.Cyfansoddyn pysgysol
Mae yna ddau PLA^Ei ac E2 gwahanol o wenwyn neidr, lle mae 仏 yn bodoli ar ffurf dimer, mae'r dimer yn weithredol, ac mae ei fonomer dadunol yn anactif.Roedd Lu Yinghua et al.(1980) astudio ymhellach briodweddau ffisegol a chemegol a chineteg adwaith E. Jayanthi et al.(1989) ynysu PLA2 sylfaenol (VRVPL-V) o wenwyn gwiberod.Pwysau moleciwlaidd y monomer PLA2 yw 10000, sydd ag effeithiau angheuol, gwrthgeulo ac oedema.Gall yr ensym polymerize polymerau â phwysau moleciwlaidd gwahanol o dan gyflwr PH 4.8, ac mae gradd polymerization a phwysau moleciwlaidd polymerau yn cynyddu gyda chynnydd tymheredd.Pwysau moleciwlaidd y polymer a gynhyrchir ar 96 ° C yw 53 100, ac mae gweithgaredd PLA2 y polymer hwn yn cynyddu gan ddau
Amser postio: Tachwedd-18-2022